MHC-I Tetramer

                                                               检测抗原特异性T细胞的试剂

      MHC-I 四聚体试剂作为T细胞免疫应答的必要监测工具，广泛应用于传染病及癌症疫苗疗法、细胞免疫疗法、移植免疫、自身免疫疾病等基础研究或临床开发领域中。

MHC-I 四聚体检测抗原特异性 T 细胞的原理：

      蛋白类抗原在抗原呈递细胞（antigen-presenting cell, APC）内加工成特定的多肽序列，通过 APC 上表达的 MHC分子呈递到细胞表面形成 MHC-肽复合物， MHC-肽复合物被特异的T 细胞受体（TCR）识别，并结合，从而激活该MHC-抗原特异性 T 细胞。根据该原理，可以利用 MHC-肽复合物检测抗原特异性 T 细胞。但是，当 MHC-肽复合物处于单体（Monomer）状态时，对 TCR  的亲和性较低， 且二者的结合不稳定，因此很难将单体作为检测工具使用。 若将 MHC-肽复合物生物素化，通过链霉亲和素将 MHC-肽复合物单体四聚体（Tetramer）化，就可以使其与 TCR 保持在一个稳定的结合状态，成为可以利用的检测工具。

MHC-I 四聚体是检测抗原特异性T细胞的金标准

MHC-I四聚体检测抗原特异性T细胞的染色方法1

■ 全血

1）采集静脉血于肝素采血管中。

2）在200μL的全血中加入1-2μL的T-SelectMHC Tetramer-PE（建议稀释比例为1:100-1:200）。

3）轻柔地进行涡旋震荡混合。

4）在室温下孵育20 分钟，或者在4℃下孵育30 分钟。

5）加入CD8 抗体等，在室温下孵育20 分钟，或者在4℃下孵育30 分钟。

6）使用 OptiLyse C 或者OptiLyseB 进行溶血、固定处理。请按照各自说明书中的方法进行操作。

7）溶血、固定的操作结束后，加入适量的 PBS 重悬细胞。

8）400 x g，离心5 分钟。

9）小心地去掉上清，用 500μLPBS 重悬细胞。* 请将样品于4℃避光保存，并在24 小时内进行分析。

★ 溶血处理不充分时，可以观察到红细胞漫反射引起的非特异性染色。请利用CD45同时染色，并通过淋巴细胞门进行分析，通过 CD45 染色将红细胞漫反射 gate out 处理，可以降低干扰。

MHC-I四聚体检测抗原特异性T细胞的染色方法2

■人外周血单核细胞（HumanPBMC）、小鼠脾细胞（Mouse splenocyte）、常规细胞系等

1）按照常规方法制备细胞，用FACS Buffer（PBS+ 2%小牛血清+0.1%叠氮钠；建议使用时新鲜配制）重悬细胞，使浓度在 2-5×106-7cells/mL，取 25ul 细胞悬浮液滴加入微孔培 养板或 FACS 试管。

2）制备 2X Staining Cocktail：FACS Buffer+ MHC 四聚体（建议稀释比例为 1:50～1:100）

3）取 25ul 2X Staining Cocktail，滴加入步骤 1 中的微孔培养板或 FACS 试管，与细胞悬浮液混匀。（注意：使用移液器轻柔上下吹打混匀，尽可能避免产生气泡。）

4）在冰上或其他已通过实验优化确认的最佳温度条件下，避光孵育30-60分钟。

5）加入 Anti-CD8/FITC 抗体或其他用作内参的抗体（请参考其说明书进行稀释），4℃避光孵育 20分钟。

6）加入 150ul FACS Buffer 至微孔培养板每孔或 2-3ml FACS Buffer 至 FACS 试管，轻柔混匀，避免形成气泡，1200 rpm 离心 5 min，小心除去上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。（注意：对于具有传染性或危害性的样本，可考虑使用吸引器， 轻柔吸掉上清液，尽可能不要触碰到细胞沉淀，减少细胞损失。）

7）重复步骤 6，再洗涤 2 次。

8）将细胞重悬于 200ul 固定液（PBS+1%多聚甲醛（PFA））中， 使用流式细胞仪进行样本分析。

注意：先使用四聚体试剂染色，然后使用 CD8 抗体进行染色，会使染色效果更好。

MHC-I四聚体染色注意事项

1 染色体系的体积应尽可能小，以节约试剂。例如： 25ul 2X Staining Cocktail + 25ul 细胞悬浮液=50ul。

2 所有操作应尽量在 4℃条件下进行。 一些 MHC 四聚体在室温或更高温度条件下， 能获得更高强 度的亲和力，可提高染色效果。但另一些细胞表面标志物，比如 CD62L，对较高的温度条件往 往比较敏感。部分 MHC 四聚体已被证实，在 37℃条件下容易与细胞解离。故我们建议：在 4℃

条件下孵育 45-60 分钟， 或在室温条件下孵育 30 分钟。

3 在进行大规模试验前，建议先进行预试验，以确定最佳的 MHC  四聚体稀释比例。通常，建议 MHC 四聚体的初始稀释比例为 1:100～1:200。请根据具体实验，优化其稀释比例， 以期获得最

佳的染色效果。

4 对于新鲜的外周血单核细胞、淋巴细胞、脾细胞， 通常建议每个染色样品细胞总数为 1-2 ×106； 而对于细胞克隆或者 CTL 细胞系，每个样品细胞总数可减低为 2 ×105。当针对细胞克隆染色时，

建议选取具有不同特异性的其它克隆细胞作为阴性对照。

5 试剂应按照良好实验室规范进行管理，操作人员应受过专业的培训和具有操作经验，避免吸入和皮肤接触。

6 避免试剂被微生物感染。

参考文献：

1.   Altman J.D., Moss P.A.H., Goulder P.J.R., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.

Science 1996, 274(5284): 94-6.

2.   Xie et al. A dual-function epidermal growth factor receptor pathway substrate 8 (Eps8)-derived peptide exhibits a potent cytotoxic T lymphocyte-activating effect and a specific inhibitory activity. Cell Death and Disease (2018) 9:379.

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